实训四 试管苗叶片接种

一、目的要求：熟练掌握培养基的制作过程，掌握试管苗的叶片接种过程。
一、仪器及试剂：超净工作台及配套接种用具(无菌接种工具、酒精灯、
酒精棉球、70%酒精瓶，无菌培养皿、打火机等)
四、 试验材料： 取矮牵牛等试管苗的叶片。选择长势好，大小适中
的种苗。每个超净台配给2瓶种苗。
五、 空白培养基：每人准备预先做好的10瓶空白培养基
四、学生安排：
接种时每6人为一组，
五、操作步骤
.　　1.接种前4小时对接种室进行熏蒸，每个超净台取10ml左右甲醛液装
入瓶中，在超净台边加入5克左右高锰酸钾，立即放入超净台里；
接种前20-30分钟接通电源，打开紫外灯和风机。
2．洗净双手，穿好专用实验服进入接种室，用酒精棉球擦试双手，台面及
接种工具等。
3． 将酒精灯放在距超净台边缘约30cm，正对胸前处，注意以后的操作都要
在酒精灯的10cm半径范围内完成。点燃酒精灯，对剪子和镊子过火，先从头
至尾过火，然后对尖端反复过火；将种苗瓶放在灯前偏左处；将空白培养基
瓶放在灯前偏右处；将接种用培养皿放在距超净台边缘约15cm，正对胸前处，
以利操作的方便进行。
4．打开原种瓶，对瓶口先外壁，后内壁过火。然后准备接种：先将种苗移到
培养皿里。对种苗选择叶片，然后将叶片切成小块，大小约0.5厘米见方，注
意选择近中脉位置。
每瓶接4—5个叶小块，若放4株呈正方形分布。若放5株最后一株要放在正方形
对角线交点处。接好后，瓶口和封口膜均要过火，扎口。每接完一瓶，接种工
具要放回酒精消毒瓶。
5接完10瓶种苗后，写好标签，移出超净台，置于塑料筐里。
7接种完毕，熄灭酒精灯，盖上酒精瓶，收拾净超净台面，先把种苗瓶移出，
然后将废物皿、空原种瓶、培养皿、接种工具等移出放到塑料筐里，带出接种
室，清洗干净。
8接后的培养物转移到培养室进行培养。3天后，经常检查污染情况，及时清除
培养瓶。
实训五 茎尖、茎段外植体接种培养
(一) 实训目的
通过实践熟练掌握茎尖、茎段培养环节中培养基制作，外植体选材，灭菌，
接种，培养观察等技能。
(二) 实训时期
春、秋两季均可
(三) 实训材料
菊花等植物茎梢。
(四) 实训场地
组培实验室
(五)实训安排
1．配制培养基时每四人一组，每组做一升培养基。即每人平均10瓶培养基。
2．采取材料和接种时按每6人为一组。
(六) 接种过程　（培养基配制略）
1.外植体选取、灭菌和接种
(1)选取无病无虫害健康幼嫩枝条，剪成3-4cm大茎段，剪去叶片，只留叶柄，
流水冲洗干净，用75%酒精浸泡半分钟，再用0.1%升汞浸泡5-8分钟，最后用无
菌水冲洗5-8次，每组选大茎段至少10个。
(2)配制分化培养基，配方为MS+BA　1+NAA0.2-0.5，每培养瓶含25-30ml培养
基。
(3)在无菌条件下，将枝条切成含一个茎节的小段，茎节上留1/3茎节长，节
下留2/3 茎节长。切除多余的嫩叶，只留叶柄。每培养瓶接入1-2枚茎尖或
茎段。每组接种20瓶。
2.培养观察与对策
(1)接种后3-10天内每天定期观察一次，以后每周观察1-2次，及时剔污染，
记录生长状态，发现侧芽萌发或顶芽生长者视为接种成活。
(2)当侧芽或顶芽长至3-5厘米，可进行培养，时用MS0培养基，以切割茎段
方式进行繁殖。
(3)当繁殖到50株苗左右可进行生根培养，生根用1/2MS0+NAA0.01培养基，
无根苗生出约1厘米长，洁白而浓密粗壮的根为最佳，每组有生根苗50株，即10瓶。
(五) 实训思考和作业
1. 外植体灭菌时，会出现什么问题？你怎么处理？
2. 培养时会出现什么问题？你怎么解决？
3. 写出茎尖茎段培养的实训报告。