9 原生质体培养
目的要求：
1A= 294; = 102;解原生质体培养的意= ;义所在
2A= 294; = 484;握原生质体分离的大= ;致步骤
3A= 294; = 484;握原生质体培养的方= ;法
4A= 294; = 484;握原生质体融合的方= ;法
9.1 Ö= 07;生质体培养的意义
原生ฝ= 6;体是通过质壁分离与&= #32454;胞壁分开的部分，= 159;能存活的植物细胞的= ;最小单位。
原生体培养成为生୰= 9;技术最重要的进展之&= #19968;。通过大量的试验"= 920;明，没有细胞壁的原= ;生质体仍然具有“全= 3021;性”，可以经过离߮= 7;培养得到再生植株。<= span lang=3DEN-US>原生质体的分బ= 3;研究较早,
发现ࡥ= 0;：
1)1= 892年Klercker首先用机械= 861;分离得到原生质体= 5292;将叶肉细胞，愈伤ಭ= 2;织和液体悬浮培养细&= #32990;置于高渗的糖溶液= 013;，使之质壁分离，原= ;生质体收缩成球形。&#= 36825;时用剪刀剪碎组织ʌ= 92;就有可能切开细胞壁= 后获得少量完整的原= 9983;质体。但数量少且ਵ= 1;受损伤。
2)1= 960年，英国植物生理&= #23398;家Cocking首先用酶解法= 从蕃茄幼苗的根分离= 1407;生质体成功。他使用一种由= 5;孢漆斑菌培养物制备&= #30340;高浓度的纤维素酶 = 342;液降解细胞壁。
3)<= /span>直至1960年后纤维素酶= 1644;离析酶成为商品酶= 7;入市场，植物原生质&= #20307;研究才成为一个热&= 376;的领域。
4)<= /span>至今从植物体的几È= 46;每一部分都可分离&= #24471;到原生质体。己从 = 895;草、胡萝卜、矮牵牛= ;、茄子、蕃茄等70种植物的原生ũ= 36;体再生成完整的植株= 。
5)<= /span>原生质体融合，体ń= 54;胞杂交的技术也得到= 广泛的应用。
1)= 再生植株，其优点= 159;：(1)可利用均一的= 998;化细胞的群体。
(2)= 因无细胞壁，试剂= 545;细胞作用更为直接，= ;其反应能直接测量= 5292;以便反应产物能较গ= 5;的分离出来。
(3)= 在理论研究和生产= 454;践中，可极大地节 = 465;空间，如在一个三= 5282;瓶就能培养210个细胞，但&= #22312;大田种植需要4亩地。
(4)= 可缩短实验周期，= 914;悬浮培养时仅需1～2天时= 8388;。
原生= ;质体培养可在遗传学&#= 26041;面进行基因互补，Ç= 81;亲和性，连锁群和基= 因鉴定，分析基因的= 8608;活和失活水平的研ి= 0;。在研究分化问题时&= #65292;用一个均一的原生$= 136;体群体可以筛选数以= ;千计的不同物理、营&#= 20859;和激素条件，探索Ŧ= 25;导单细胞的分化条件= 等。
2)用于远缘体细 = 990;融合，进行体细胞杂= ;交。这是一种新的远&#= 32536;杂交方法。亲缘关Ŀ= 95;较远的两个植株用一= 般杂交是不易成功的= 5292;而用细胞融合的方ૢ= 1;却有可能。首先，两&= #20010;原生质体融合形成= 322;核体，异核体再再生= ;细胞壁，进行有丝分&#= 35010;，发生核融合，产ī= 83;杂种细胞，由此可培= 养新的杂种。
9.2原生ฝ= 6;体的分离
要分= ;离植物原生质体，必&#= 39035;去掉由果胶质、纤Ņ= 00;素和半纤维素及木质= 素等构成的细胞壁，= 2312;本世纪前期是采用= 6;械法分离。这种方法&= #20998;离的原生质体太少A= 292;且只能适于部分组织= ;，Cocking发明的酶解法= ;，开创了大量分离原&#= 29983;质体的新技术，现ß= 12;被普遍应用。
一般来说根、茎、叶= ;、花、果实、种子及&#= 24840;伤细胞和悬浮细胞Ļ= 61;都可作为分离原生质= 体的材料。但要选用= 9983;长旺盛、生命力强= 0;组织作材料。以下是&= #24120;选用的材料：
1)细胞悬浮培养Ĥ= 89;
在建ే=
5;细胞悬浮培养物之前&=
#65292;需提前培养愈伤组&=
#32455;。取用成熟种子胚=
、未成熟胚、幼穗、=
3457;药、胚芽鞘或幼叶ᦁ=
2;经无菌消毒后，在含<=
span
lang=3DEN-US>2～4mg/L的2,4-D的MS固߮=
7;培养基上，在
2)叶肉细胞
叶肉= ;细胞是分离原生质体&#= 30340;最好的细胞材料，ī= 92;叶片的薄壁组织作为= 材料来源，要考虑植= 6666;的生长环境，叶片= 0;年龄及其生理状态对&= #21407;生质体分离的影响= 290;取生理状态适宜的叶= ;片，有利于原生质体&#= 30340;细胞再生和细胞分Ş= 10;。要获得良好的培养= 材料，下列因素是考= 4385;的重要因子：
①光= 强为3000～6000Lx。
②温=
度为20～
③相= 对湿度在60～80％左&= #21491;。
植物= ;的其它器官也可用于&#= 20998;离原生质体，如用Ŏ= 57;粉四分体和花粉壁细= 胞。
3)<= /span>植物材料的预处理
对原=
生质体材料进行预处=
9702;能提高原生质体的࠳=
8;裂频率；也可以逐步&=
#25552;高植物材料的渗透=
387;，以适应培养基中的=
;高渗环境。这些处理&#=
21253;括暗处理、预培养z=
89;低温处理等。把豌豆=
的枝条取下后，在分=
1163;原生质体前，先让=
8;料在黑暗中的一定湿&=
#24230;条件下放1～=
2天，这样得到的=
原生质体存活率高，=
4182;能继续分裂；在羽ඣ=
5;甘蓝叶肉组织原生质&=
#20307;分离和培养中，先=
435;掉叶片的下表皮，再=
;在诱导愈伤组织的培&#=
20859;基中预培养7天，然后&#=
20877;去壁。经预培养的Ö=
94;片分离的原生质体高=
度液泡化，叶绿体也=
5299;体；龙胆试管苗的ࡥ=
4;片只有用
1)<= /span>酶的种类
构成ઁ= 3;物细胞壁的三个主要&= #25104;分是：①纤维素，Õ= 44;细胞壁干重的25%至50%不等= ;。②半纤维素，平均= 2422;占细胞壁干重的53%左右。③果胶ũ= 36;，一般占细胞壁的5%。 分离原生质= 307;最常用的酶有纤维素= ;酶、半纤维素酶和果&#= 33014;酶。
纤维ಃ= 2;酶是从绿色木霉中提&= #21462;的一种复合酶制剂A= 292;主要含有纤维素酯C1，作用于天然į= 40;和结晶的纤维素，具= 有折断天然纤维素的= 0316;用，还含纤维素Cx ，作用于定形 = 340;纤维素，可分解短链= ;纤维素，另含有纤维&#= 32032;二糖酶、木聚糖酶z= 89;萄聚糖酶、果胶酶、= 脂肪酶、磷脂酶、核= 7240;酶、溶菌酶等，总߮= 7;作用是降解纤维素，&= #24471;到裸露的原生质体= 290;
果胶= ;酶是从根霉中提取的&#= 65292;使细胞间的果胶质ƀ= 77;解，把细胞从组织内= 分离出来。半纤维素= 7238;制剂可以降解半纤ಲ= 0;素为单糖或单糖衍生&= #29289;.此外,还&#= 26377;蜗牛酶,主要用以花粉ે= 7;细胞和四分体细胞.
ZA3—867纤维酶是上海=
893;物生理研究所从野生=
;型绿色木霉同各菌种&#=
20013;提取制成的，粗制Ø=
97;是多种酶的复合物，=
含有纤维素酶（包括
日本= ;产的Onozuka纤维素酶常和= 果胶酶结合使用，可先用果胶酶༇= 7;解果胶，使分开细胞&= #65292;再用纤维素酶处理&= 477;解细胞壁。即二步法= ;降解。
2)<= /span>渗透稳定剂
植物细胞壁对细= 胞有良好的保护作用= 2290;去除细胞壁之后如ੜ= 4;溶液中的渗透压和细&= #32990;内的渗透压不同，= 407;生质体有可能涨破或= ;收缩。因此在酶液、&#= 27927;液和培养液中渗透Õ= 87;应大致和原生质体内= 的相同， 或者比细&#= 32990;内渗透压略大些。ę= 83;透压大些有利于原生= 质体的稳定，但也有= 1487;能阻碍原生质体的࠳= 8;裂。
因此= ;，在分离原生质体的&#= 37238;溶液内，需加入一ê= 50;量的渗透稳定剂，其= 作用是保持原生质体= 3180;的稳定，避免破裂Ӎ= 0;常用的有以下两种系&= #32479;：①糖溶液系统：Ô= 53;括甘露醇、山梨醇、= 蔗糖和葡萄糖等，浓= 4230;约在0.40～0.80mol/l。= 本系统还可促= 7;分离的原生质体再生&= #32454;胞壁并继续分裂。]= 13;盐溶液系统：包括KCl、MgSO4&#= 21644;KH2PO4等。其= 0248;点是获得的原生质߮= 7;不受生理状态的影响&= #65292;因而材料不必在严= 684;的控制条件下栽培；= ;不受植株年龄的影响&#= 65292;使某些酶有较大的ė= 63;性使原生质体稳定。= 另外，牛血清蛋白可= 0943;少或防止降解壁过ఴ= 3;中对细胞器的破坏。&= #36817;年来多采用在盐溶 = 082;内进行原生质体分离= ;，然后再用糖溶液作&#= 28183;透稳剂的培养基中á= 21;养。
此外= ;，酶溶液里还可加入&#= 36866;量的葡聚糖硫酸钾ʌ= 92;它可提高原生质体的= 稳定性。这种物质可= 0351;RNA酶不活化，并= 351;离子稳定。
3)酶ě= 42;液的pH值
酶溶= ;液的pH值对原生质体į= 40;产量和生活力影响很= 大。用菜豆叶片作培= 0859;材料时，发现原始pH值为5.0时= ，原生质体产生এ= 1;很快，但损坏严重，&= #24182;且培养后大量破裂= 290;当pH值提高到6.= 0时，最初原生质体= 0135;生少，但与pH值为5.0时= 处理同样时间后相比= 5292;原生质体数量显著ࣜ= 6;加。原始pH值&#= 25552;高到7.0时生活的原生$= 136;体数量进一步增加，= ;损伤的原生质体也少&#= 24471;多。
分离= ;原生质体时，首先要&#= 35753;酶制剂大量地吸附Ò= 40;细胞壁的纤维素上去= ，因此，一般先将材= 6009;分离成单细胞，然ࡧ= 8;分解细胞壁。采用将&= #37238;液减压渗入组织，= 110;将组织切成薄片等方= ;法，都可增加酶液与&#= 32420;维素分子接触的机Ê= 50;。
酶处ச= 2;目前常用的多是“一&#= 27493;法”，即把一定量= 0;纤维素酶，果胶酶和&= #21322;纤维素酶组成混合%= 238;溶液，材料在其中处= ;理一次即可得到分离&#= 30340;原生质体。
植物材料须按比= 例和酶液混合才能有= 5928;地游离原生质体，ߌ= 8;般去表皮的叶片需酶&= #37327;较少，而悬浮细胞= 017;用酶量较大。每克材= ;料用酶液10~30ml不等= 。
由于不同材料的= 生理特点不同，在研= 1350;游离条件时，必须= 7;验不同渗透压浓度的&= #32454;胞，找出适宜的渗$= 879;浓度。例如，游离小= ;麦悬浮细胞的原生质&#= 20307;的酶液中须加入0.55mol/l甘露= 醇，游离水稻悬浮细= 2990;的原生质体的酶液ߑ= 3;只加0.4~0.45mol/L的甘= 露醇，两者差别较大= 2290;
酶解处理时把灭= 菌的叶片和子叶等材= 6009;下表皮撕掉，将去ඤ= 0;皮的一面朝下放入酶&= #28082;中。去表皮的方法= 159;：在无菌条件下将叶= ;面晾干、顺叶脉轻轻&#= 25749;下表皮。如果去表į= 82;很困难，也可直接将= 材料切成小细条，放= 0837;酶液中。
对于悬浮细胞等= 材料，如果细胞团的= 2823;小很不均一，在酶= 9;前最好先用筛子过滤&= #19968;次，将在原细胞团= 435;掉，留下较均匀的小= ;细胞团进行酶解。
酶解处理一般静=
止地在黑暗中进行，=
2312;处理过程中偶尔轻๙=
1;摇晃几下。对于悬浮&=
#32454;胞，愈伤组织等难 =
216;离原生质体的材料，=
;可置于摇床上，低速&#=
25391;荡以促进酶解。酶Š=
99;时间几小时至几十小=
时不等、以原生质体=
8216;离下来为准。但是ᦁ=
2;时间过长对原生质体&=
#26377;害，所以一般不应$=
229;过24小时。酶&#=
35299;温度要从原生质体Ø=
44;酶的活性两方面考虑=
。对于这几种酶来说=
5292;最佳理论处理温度ࢷ=
2;40~
若用=
;叶片作为材料，取已&#=
23637;开的生活叶片，用0.53%次氯酸钠和70%酒精进行表面 =
781;菌，然后切成0.5厘米见方。把
若用=
;悬浮培养细胞，可不&#=
32463;过果胶酶处理，因È=
26;悬浮细胞液主要由单=
细胞和小细胞团组成=
2290;取悬浮细胞放入10ml的酶液中（3%纤维素酶，14%蔗糖, pHࠆ=
0;5.0～6.0）,在25～
1)酶Ò= 46;剂活力和纯度
粗制= ;的商品酶含有核酸酶&#= 21644;蛋白酶等杂质，它Ê= 04;对原生质体的活力是= 有害的。因此，在使= 9992;之前须将这些酶纯ࡏ= 0;，一般利用凝胶柱使&= #37238;制剂脱盐纯化。酶 = 340;活性还与pH有关。Onoznka纤维素酶R-10和离析酶= R-10的最适宜pH值分别为5<= /span>～6和4～5。不过实际上酶= 2;液的pH值经常调节4.7～6.0之间。
2)渗Ű= 79;稳定剂的作用
在分= ;离原生质体时，渗透&#= 31283;定剂有保护原生质Ë= 07;结构及其活力的作用= 。糖溶液系统可使分= 1163;的原生质体能再生ಭ= 4;胞壁，并能继续分裂Ӎ= 0;其缺点是有抑制某些&= #22810;糖降解酶的作用。 = 416;溶液系作渗透稳定剂= ;时对材料要求严格，&#= 19988;使原生质体稳定，Ë= 51;某些酶有较大活性。= 但是易使原生质体形= 5104;假壁，同时分裂后ಭ= 4;胞是分散的。
在分బ= 3;的原生质体中，常常&= #28151;杂有亚细胞碎片， = 500;管束成分，未解离细= ;胞，破碎的原生质体&#= 20197;及微生物等。这些ę= 51;杂物的存在会对原生= 质体产生不良影响。= 7492;外，还需去掉酶溶= 2;。以净化原生质体。<= /p>
原生质体纯化常用Ű= 07;滤和离心相结合的方= 法，步骤大致如下：
1） =
将原=
生质体混合液经筛孔=
2823;小为40~100μm的滤网过滤，༊=
0;去未消化的细胞团块&=
#21644;筛管、导管等杂质A=
292;收集滤液。
2） = 将&= #25910;集到的滤液离心，$= 716;速以将原生质体沉淀= ;而碎片等仍悬浮在上&#= 28165;液中为准，一般以500转/分离&= #24515;15分钟。用吸管Ŧ= 80;慎地吸去上清液。<= /p>
3） = 将&= #31163;心下来的原生质体%= 325;新悬浮在洗液中（除= ;不含酶外，其他成分&#= 21644;酶液相同），再次ķ= 63;心，去上清液，如此= 重复三次。
4） = 用培= 养基清洗一次，最后= 9992;培养基将原生质调࠸= 0;一定密度进行培养。&= #19968;般原生质体的培养= 494;度为104~106/ml。
在原生质体培养= 前，常常先对原生质= 0307;的活性进行检测。૭= 9;定原生质体活性有多&= #31181;方法，如观察胞质 = 615;流、活性染料染色、= ;用荧光素双醋酸酯（FDA）染= 色等。这些方法各有= 9305;点，但现在一般用= 0;是FDA染色= 法。FDA本身= 无荧光，无极性，可= 6879;过完整的原生质体= 0;。一旦进入原生质体&= #21518;，由于受到脂酶分#= 299;而产生有荧光的极性= ;物质荧光素。它不能&#= 33258;由出入原生质体膜ʌ= 92;因此有活力的细胞便= 产生荧光。而无活力= 0340;原生质体不能分解FDA，因= 此无荧光产生。FDA染色= 测活性的方法如下：
取洗=
8;过的原生质体悬浮液<=
span
lang=3DEN-US>0. 5ml，置于10×
9.2 原生ũ= 36;体培养
将有ஶ= 3;活力的原生质体在适&= #24403;的培养基和培养条= 214;下培养，很快就开始= ;细胞壁再生和细胞分&#= 35010;的过程。约1～2个月= 1518;，通过细胞的持续࠳= 8;裂，在培养基上出现&= #32905;眼可见的细胞团。 = 454;胞团长到2～4mm左右&= #65292;即可转移到分化培= 859;基上，诱导芽和根长= ;成完整的植株。
原生质体的培养= 方法大体和细胞培养= 0456;同，有固体培养、= 2;体培养及固液结合培&= #20859;等几种方法。
1).固体= 培养法
该法是将悬浮在= 液体中的原生质体悬= 8082;与热融的含琼脂的࣌= 1;养基等量混合，使琼&= #33026;的最终浓度为0.6%左右= ，冷却后原生质体包= 2475;在琼脂培养基中。ஸ= 1;于原生质体被机械地&= #24444;此分开并固定了位 = 622;，这种方法避免了细= ;胞间有害代谢产物的&#= 24433;响并便于定点观察ʌ= 92;追踪单个细胞的发育= 过程。
饲养培养是固体= 培养法的引伸。将原= 9983;质体与一些射线处ச= 2;过的原生质体用一薄&= #23618;琼脂培养基固定在= 979;层，而活的原生质体= ;在上层。这种方法允&#= 35768;原生质体密度低于Ŋ= 21;生长的密度，因为它= 们可以从被处理过的= 1407;生质体那里获得一ߜ= 3;有益的物质。
固体共培养方法= 也是饲养培养的一种= 6041;式，即把一种已知೦= 1;快速生长的原生质体&= #21644;一种难以培养的原 = 983;质体相混合，然后用= ;琼脂培养基固定共同&#= 22521;养。这种方法使难É= 97;培养的原生质体得益= 于快速生长的原生质= 0307;所产生的并易扩散= 0;物质。
由于琼脂熔点较= 高，因此在固定培养= 0013;保持琼脂培养基较ོ= 0;的温度和相对剧烈的&= #25671;动是使原生质体在= 521;养基中分布均匀的前= ;提，这样就容易对原&#= 29983;质体造成伤害。此ä= 06;，琼脂对原生质体是= 有毒害的，只能是一= 0123;生命力较强的植物= 7;生质体才可以用这种&= #21150;法来培养。为此，= 154;们不断寻求低毒并可= ;在常温下凝固的物质&#= 26469;代替琼脂，
近年来很多实验= 证明，琼脂糖是一个= 3391;好的培养基凝胶剂ᦁ= 2;它不仅具有熔点低的&= #29305;点而且具有促进原 = 983;质体再生细胞分裂的= ;作用。对琼脂糖、琼&#= 33026;及经过漂洗的纯净į= 40;琼脂的比较试验，发= 现尽管纯净的琼脂可= 0197;提高一些原生质体= 0;植板率，但最好的结&= #26524;是在琼脂糖上取得 = 340;，并且琼脂糖适用于= ;广泛的植物种。他们&#= 21457;现在琼脂中不能分Ş= 10;的天仙子属的一种在= 琼脂糖中能持续分裂= 4182;且比在液体培养基ߑ= 3;形成细胞团的频率高&= #12290;在琼脂糖培养基中A= 292;烟草原生质体发育到= ;细胞团所需的接种密&#= 24230;要比在琼脂或液体á= 21;养基中的低。在水稻= 原生质体培养也证实= 5292;提高琼脂糖的浓度ࡤ= 7;以明显地提高原生质&= #20307;的引起的出芽现象A= 292;从而提高了培养初期= ;的原生质体的成活率&#= 12290;
由于上述原因，= 琼脂糖作为一种优良= 0340;凝胶剂，在原生质߮= 7;培养中的应用越来越&= #24191;泛。
2)液体培养
液体培养法是在= 培养基中不加凝胶剂= 5292;原生质体悬浮在液߮= 7;培养基中，常用的是&= #28082;体浅层培养法，即= 547;有原生质体的培养液= ;在培养皿底部铺一薄&#= 23618;。这种方法操作简Ì= 15;，对原生质体伤害较= 小，且便于添加培养= 2522;和培养物的转移，= 9;目前原生质体培养工&= #20316;中广泛应用的方法= 043;一。其缺点是原生质= ;体在培养基中分布不&#= 22343;匀，容易造成局部ê= 94;度过高或原生质互相= 粘连而影响进一步的= 9983;长发育，并且难以ऩ= 0;点观察，很难监视单&= #20010;原生质体的发育过 = 243;。
在固体培养法中= 提到的饲养培养和共= 2521;养，也可以用液体࣌= 1;养的方法。
微滴培养法是液= 体培养的一种方式。= 3558;悬浮有原生质体的࣌= 1;养液用滴管以 0.1ml左右= 的小滴接种在无菌且= 8165;洁干燥的培养皿上ᦁ= 2;由于表面张力的作用&= #65292;小滴以半球型保持= 312;培养皿表面，然后用= ;Parafilm封口= ，防止干燥和污染。= 2914;果把培养皿翻转过= 9;，则成为悬滴培养。&= #30001;于小滴的体积小，= 312;一个培养皿中可以做= ;很多种培养基的对照&#= 23454;验。如果其中一滴û= 10;几滴发生污染，也不= 会殃及整个实验。同= 6102;也容易添加新鲜培ࠥ= 9;基。其缺点也是原生&= #36136;体分布不均匀，容= 131;集中在小滴中央。此= ;外由于液滴与空气接&#= 35302;面大，液体容易蒸Ö= 57;，造成培养基成分浓= 度的提高。解决蒸发= 8382;题最简单的办法就= 9;在液滴上覆盖矿物油&= #12290;
有些研究工作需ව=
1;进行单个原生质体培&=
#20859;。如选择出的特定 =
340;原生质体和经融合处=
;理后数量很少的融合&#=
20307;等。已有实验证实ʌ=
92;单个原生质体的单独=
培养的关键在于培养=
2522;原体积要特别小。ࣳ=
4;油菜单个的原生质体&=
#39035;培养在50nl的培=
养基中，这种比例相=
4403;于每毫升培养基有2×104个原生质体，在这ķ=
81;条件下，原生质体的=
再生细胞可以持续分=
5010;直到形成愈伤组织Ӎ=
0;这样小体积的微滴，&=
#26159;极易蒸发的，为此A=
292;Koopt 设计=
了一个特殊的装置：=
9318;先，在一个长度为3350μ
最简便的固液结ࡧ= 2;方法是在培养皿的底&= #37096;先铺一薄层含凝胶= 058;的固体培养基，再在= ;其上进行原生质体的&#= 28082;体浅层培养。这样ʌ= 92;固体培养基中的营养= 成分可以慢慢地向液= 0307;中释放，以补充培ࠥ= 9;物对营养的消耗，培&= #20859;物所产生的一些有= 475;物质，也要被固体部= ;分吸收，对培养物的&#= 29983;长更有利。已证明Ű= 25;种方法对烟草和矮牵= 牛原生质体的再生质= 0307;的再生细胞起到了߹= 9;进分裂的作用。基于&= #26377;效地吸附培养物所= 135;生的有害物质的考虑= ;，在下层固体培养基&#= 20013;添加了活性炭，结ĉ= 24;使地钱原生质体形成= 细胞团的数量提高了23倍。
由于很多实验已=
7;实了琼脂糖比琼脂更&=
#36866;于原生质体培养，$=
817;年来又发展了琼脂糖=
;固体培养和液体培养&#=
30456;结合的方法。用几ķ=
81;植物的原生质体做实=
验，发现尽管琼脂糖=
5552;高了植板率，但到ಭ=
4;胞团阶段后就难以再&=
#32487;续发育。他们认为$=
825;可能是由于培养物把=
;固体培养基中的营养&#=
28040;耗尽了所造成的。É=
82;们发展一种“念珠培&=
#20859;”法，即把含有原ī=
83;质体的琼脂糖培养基=
切成块放到大体积的=
8082;体培养基中，并在ਭ=
9;转摇床上震荡以利于&=
#36890;气。使用大体积的 =
082;体是为了防止琼化糖=
;块过度破碎。用这种&#=
26041;法，有不仅进一步ÿ=
52;高一些种，如番茄原=
生质体的植板率，而=
9988;使一些以前从未超=
7;细胞团阶段的种，如&=
#33436;菁和矮牵牛原生质=
307;能够持续地分裂。在=
;水稻原生质体培养中&#=
20351;用的琼脂糖珠培养Ė=
61;也是固液结合的一个=
好方法。把含有原生=
6136;体的琼脂糖培养基ߣ=
7;大约50μl一滴，滴在直径=
1)培养基成份
&n= bsp; 原生质体&#= 22521;养和其它组织培养Ç= 68;样，培养基中需要氮= 、磷、钾、钙、镁、= 0827;及铁等大量元素，ߣ= 7;及锰、锌、钼、铜和&= #38068;等微量元素营养源= 290;同时还需要糖类物质= ;和许多有机营养，以&#= 21450;添加适当浓度的激ŀ= 32;。由于和细胞培养相= 比，只去除了细胞壁= 5292;因此原生质体培养࣌= 2;一般是加以改变的细&= #32990;培养基。如原生质= 307;培养经常使用的KM-P培养= 基就是以B5培养= 基为基础；NT培养基则&#= 20197;MS培养基为&#= 22522;础。但原生质体无ť= 70;在结构上和代谢生理= 上和细胞毕竟有很大= 4046;异，在培养原生质߮= 7;时，单纯地模仿细胞&= #22521;养基往往不能达到 = 385;意的培养效果，需要= ;考虑到原生质体的独&#= 29305;要求。
2)渗透压稳定剂<=
/p>
由于去除了细胞=
壁，原生质体培养基=
0013;须有一定浓度的渗=
9;压稳定剂来保持原生&=
#36136;体的稳定。常用的=
159;甘露醇、山梨醇、蔗=
;糖及葡萄糖等糖类。&#=
22240;为这类物质既保持á=
21;养基的渗透浓度，又=
是原生质生长发育的=
0899;源，因此其种类和૮=
7;度会影响培养效果。&=
#23545;原生质体培养来讲A=
292;蔗糖不如葡萄糖。用=
;葡萄糖代替甘露醇，&#=
21487;提高原生质体的植Ĉ=
95;率。近年来许多实验=
证实葡萄糖是原生体=
2521;养中比较理想的渗=
9;压稳定剂和碳源。
不同的糖类，只=
对培养效果发生影响=
5292;在游离时，并无显഻=
9;影响。说明在原生质&=
#20307;发育时，对碳源有=
968;定的要求。随着细胞=
;壁的再生和细胞的持&#=
32493;分裂，渗透剂的浓ò=
30;须不断降低，才对培=
养物的生长有利。用=
8155;加鲜培养基的方法=
7;行杨树原生质体培养&=
#65292;每周使渗透剂的浓=
230;降低0.1mol/l，导=
致了培养物的持续生=
8271;，发育成愈伤组织ॲ=
2;分化成再生植株。
.3)无机=
盐 无机盐以离子状=
态存在于培养基中，=
6131;于被植物细胞吸收ࡴ=
4;利用，无机盐是培养&=
#22522;的主要构成成分，=
681;据其含量，可分为大=
;量元素和微量元素两&#=
37096;分。 在大量元素中，=
对原生质体培养效果=
4433;响最大的是Ca2+和<=
span
lang=3DEN-US>NH4+
虽然氮源是植物= 细胞不可缺少的营养= 5292;但已发现高浓度的NH4+可抑制马铃薯原生ũ= 36;体的生长发育不利。= 在有关菊苣叶肉原生= 6136;体培养时，把MS培养基中&#= 30340;氨和硝酸盐全部去þ= 81;，只用谷氨酰胺作为= 氮源，得到了好的结= 6524;。把水稻原生质在B5培养基上&#= 22521;养8~10天后= ，转移到完全去除无= 6426;氮素，而用4种氨基酸&#= 20316;为氮源的AA培养基上&#= 65292;获得了来源于原生ũ= 36;体的水稻再生植株。=
3)有机成分
原生质体的生长= 发育需要维生素类及= 1508;种有机成分，在培ࠥ= 9;蚕豆属的一个种的原&= #29983;质体时，为了适应= 302;密度的培养，人们设= ;计了KM-P培养= 基，它包括丰富的维= 9983;素、氨基酸、有机ຌ= 0;、核苷酸、糖及糖醇&= #31561;有机成份。后来这= 010;培养基在原生质体培= ;养中得到广泛应用。&#= 30740;究表明：多胺类物ũ= 36;对原生质体发育有一= 定的促进作用。有些= 5253;道认为：在培养基ߑ= 3;添加一些天然有机物&= #36136;对原生质体的生长= 377;利，如酵母提取物、= ;椰乳等。
4)激素
激素对原生质体= 的生长发育是非常重= 5201;的。但由于不同的ઁ= 3;物种对激素的种类和&= #27987;度有很不同的要求A= 292;对牛豆树原生质体培= ;养认为2,4-D对细= 胞分裂是必不可少的= 5292;并且不能用NAA和<= span lang=3DEN-US>IAA来代= 替，这种在细胞内合= 5104;的激素和其他细胞ࠦ= 9;物质向外释放时，外&= #28183;的速度和能力也不 = 456;同。内源激素外渗后= ;，提高了培养基中激&#= 32032;的浓度使得不同植Ĥ= 89;原生质体对外源激素= 的种类和浓度的需求= 0135;生了很大差异。
由于细胞在培养= 过程中能够合成一些= 9289;质并外渗到培养基ߑ= 3;，利用这个特点来制&= #25104;“条件培养基”，ࡘ= 3;对某种材料的细胞培&= #20859;一定时间后，培养= 522;中已含有这种材料外= ;渗的激素、氨基酸等&#= 29289;质，再把这种材料į= 40;细胞去掉。用这种条= 件培养基足以促进其= 0182;材料的细胞生长。ஷ= 2;培养了3天的长春&#= 33457;细胞的悬浮培养液Ë= 16;“条件培养基”，加&#= 21040;长春花原生质体培Ð= 59;基中，极大地促进了= 长春花原生质体的生= 8271;和分裂。用条件培ࠥ= 9;基作烟草原生质体低&= #23494;度培养也提高了培= 859;效果。
尽管原生质体培= 养对激素的种类和浓= 4230;的要求有很大差异ᦁ= 2;但总的来说，生长素&= #21644;细胞分裂素是需要 = 340;，并需要二者的适当= ;搭配。同时，在不同&#= 30340;发育阶段需要不断ß= 20;对激素的种类和浓度= 进行及时的调整。此= 2806;，在每一步调整激ಃ= 2;时，还须考虑到它的&= #21518;效应。如牛豆树原 = 983;质体培养中，再生细= ;胞的起始分裂需要有2,4-D存在= ，但它对以后的器官= 0998;化却有抑制作用。= 0;实际上，器官分化的&= #20915;定因素在愈伤组织= 418;成的初期就发生了，= ;如果只为了愈伤组织&#= 30340;发育而继续保留较ƌ= 40;浓度的2,4-D，就= 有可能抑制器官发生= 2780;使原生质体培养不೦= 1;获得再生植株。
5)pH值<= /p>
原生质体培养基= 的pH值一般为5.6~5.8pH值除= 了直接影响原生质体= 1450;再生细胞的生理活ࡄ= 0;外，还能影响外源生&= #38271;素是否对培养物产 = 983;毒害。当pH6.4时，= 2,4-D的浓= 度即使到达30mg/l，细= 胞也还能持续分裂。= 6824;有人认为原生质体ଅ= 6;离时的pH值对培养&#= 25928;果也有影响。在酶Ę= 82;的pH为= 5.5时，豇豆原生质= 体的产量最高，但pH为= 6.0时产生的原生质= 体才具有持续的细胞= 0998;裂能力。
无机= ;营养中铁、钙、铵等&#= 30340;浓度对原生质体培Ð= 59;有重要影响。铁盐大= 多采用MS培养基中的铁İ= 16;浓度。但当把MS培养基中的铁İ= 16;浓度降低10倍时，则可以ä= 23;大增加原生质体存活= 和分裂的数量；适当= 5552;高培养基中钙浓度ᦁ= 2;降低铵盐浓度，有利&= #20110;原生质体的存活， = 454;胞再生和继续分裂。= ;豌豆在高钙中3天后已有10%= 原生质体或再生细 = 990;分裂，而在低钙中则= ;只有3%。马铃薯原生ũ= 36;体只在100mg/L的铵盐中仅2～3天内= 3601;死亡。
6)培Ð= 59;基原生质体密度的影= 响
原生ฝ= 6;体培养基中原生质体&= #30340;密度对分裂的影响= 456;大，培养的适宜密度= ;在104～105= 个/ml左右。在烟草= 494;原生质体培养中，密= ;度低于103个/ml= 102;，细胞只能分裂一、= ;二次，且能持续进行&#= 19979;去，密度在104个/ml= 197;上，植板率常显著提= ;高。低密度条件原生&#= 36136;体不能生长的原因ʌ= 92;可能在于细胞代谢产= 物扩散到培养基中去= 5292;而影响细胞内的浓ॷ= 0;。如在培养基中添加&= #33509;干代谢中间产物，= 302;密度的原生质体生长= ;发育也能正常进行。
9.3的融ࡧ= 2;
通过= 7;生质体融合可实现体&= #32454;胞杂交，这是70年代兴起的一Ɔ= 33;新技术。因为应用植= 物的根、茎、叶等营= 0859;器官及其愈伤组织= 0;悬浮细胞的原生质体&= #36827;行融合，所以称之= 026;体细胞杂交。体细胞= ;杂交育种克服了远缘&#= 26434;交中某些障碍，如Ĉ= 34;交不亲和性等，从而= 更广泛地组合各种植= 9289;的遗传性状，为有ਠ= 8;地培育新品种，开辟&= #20102;一条崭新的途径。
1) 融合&#= 26041;式
原生= ;质体的融合方式分自&#= 21457;融合和诱导融合两ľ= 67;。自发融合是在植物= 原生质体分离过程中= 5292;用酶法分解细胞壁ࡧ= 8;进行融合。这类融合&= #26159;种内融合，与胞间$= 830;丝有关，融合的个体= ;一般不能进一步发育&#= 12290;诱导融合是指制备Ñ= 86;原生质体后，加入诱= 导剂或用其它方法促= 0351;两个亲本原生质体ඎ= 1;合，诱导融合可以是&= #31181;内的，也可以是种&= 388;的，甚至是属间、科= ;间的融合。
诱导= ;融合的方法大体可以&#= 20998;为物理的和化学的È= 04;类。前者是利用显微= 操作、灌流吸管、离= 4515;或振动等机械以促߳= 1;原生质体融合，这种&= #26041;法目前多与诱导剂 = 467;合起来使用，化学融= ;合法是用不同的试剂&#= 20316;诱导剂，促使原生ũ= 36;体融合。目前常用的= 比较有效的是高pH—高钙法和聚ߚ= 8;乙醇法。
①
这是=
;受动物细胞融合研究&#=
30340;启发。用pH9.5～10.5大于0.03Mca&#=
31163;子处理原生质体，ń=
67;果融合效果较好，具=
体处理方法是：在原=
9983;质体沉淀中加入含੍=
7;
②聚= 乙二醇法
为我国学者高国楠首= ;创。聚乙二醇（PEG）分子式为HOCH2（CH2-O-CH2）nCH2OH，分子量1500～6000水ě= 42;性，pH从4.6～6.8，因多聚程度 = 780;异。由于PEG分子中醚键的= 384;在使其分子末端带有= ;微弱电荷，能与水、&#= 34507;白质、糖等极性物ũ= 36;的正极形成氢键。PEG在相邻原生质= 307;表面间作为分子桥，= ;直接或间接地= 0;过钙而起作用。当PEG分子被洗脱时A= 292;可能由于电荷紊乱和= ;再分布，或使膜表面&#= 23616;部脱水，或改变构à= 11;使类脂“液态”化而&#= 24341;起融合。具体操作Ű= 07;程如下：取等量，密= 度相近的两种不同原= 9983;质体悬浮液，在玻= 7;容器内混合均匀，取<= span lang=3DEN-US>150μ<= span lang=3DEN-US>l左右的原生质= ;体悬浮液滴在盖玻片&#= 19978;。然后缓慢加入450μ<= span lang=3DEN-US>l左右的PEG<= /span>溶液，放在20～30℃条&#= 20214;保温培养0.5～1h后用= 原生质体培养液冼净= 4701;合剂。
2)融×= 12;过程
异种= 7;生质体先经膜融合形&= #25104;共同的质膜，然后 = 463;胞质融合，产生细胞= ;壁和核融合。细胞核&#= 30340;融合是异种原生质Ë= 07;融合的关键。融合体= 只有成为单核细胞后= 5165;能继续生长，才能ࡧ= 2;成DNA、RNA，并= ;进行细胞分裂，这就&#= 35201;求两个核必须同步Ñ= 98;裂，如果两个核所处= 时期不同，一个开始= 1512;成DNA，另一&= #20010;还处于合成的中途= 110;已完成了复制，它们= ;之间就相互相互影响&#= 65292;导致最终不能进行ń= 54;胞分裂。
本章ऴ= 7;结
1A= 294; = 407;生质体培养可以再生= ;植株，可以远缘体细&#= 32990;融合达到体细胞杂É= 32;的目的
2A=
294; =
407;生质体分离可按下列=
;步骤进行：选择材料
3A= 294; = 407;生体培养时，先要纯= ;化细胞，然后接种在&#= 22266;体培养茎或液体培Ð= 59;基中
4A= 294; = 407;生质体融合采用高PH—高钙片即= ;PH9.5-10.5，0.03MCa= 788;理，或用聚乙二醇法= ;
复习জ= 5;考题：
1A= 294; = 407;生质体培养时，体细= ;胞杂交有何意义
2A= 294; = 998;离时用哪些酶，各有= ;何作用
3A= 294; = 590;样对分离粗液进行培= ;养