目的要ĕ=
14;：
1．=
;一般掌握灭菌和消毒&#=
30340;区别
2ᦁ=
4;৴=
4;握灭菌的不同方法和&=
#20855;体操作过程
3．掌握无菌接&#=
31181;的步骤 &#=
12288;
4．掌握外植体&#=
30340;培养方法和步骤
5．一般掌握外&#=
26893;体褐变和玻璃化的ã=
88;理方法
6．掌握试管苗&#=
39535;化的基本程序
7．一般掌握快&#=
36895;繁殖试管苗的计划ê=
33;排及增殖倍数计算方=
法
੍=
7;了设计良好的实验室&=
#21644;基本设备以后,应当学习组织࣌=
1;养的操作技术。包括&=
#28781;菌、接种、培养、'=
535;化等。
=
第一节 灭=
菌和接种
1੍=
7;菌范畴：凡是暴露的&=
#29289;体，接触水源的物=
307;，其表面都有菌。依=
;此未处理的无菌室、&#=
36229;净台表面、未灭菌į=
40;培养基、容器表面、=
接种刀剪、身体外表=
1450;呼吸道等，都是有മ=
0;的。
2菌的种类及特点= ：包括细菌、真菌、= 5918;线菌、藻类及其它= 4;生物。其特点是：极&= #23567;，肉眼看不见。无= 788;不在，无时不有，无= ;孔不入。忍耐力(热、射线&#= 12289;酸碱、有毒药剂等)强，生活&#= 35201;求简单，繁殖力极ó= 78;。
3ਰ=
0;菌范畴：经高温灼烧&=
#25110;一定时间蒸煮等物 =
702;方法处理，或化学药=
;剂处理，高层大气、&#=
23721;石内部、健康组织Ð=
69;部，强酸强碱，化学=
元素灭菌剂等。无菌=
9990;界要比有菌世界小এ=
1;多。
4ା=
1;菌:指用理化方法ᦁ=
2;杀死物体表面和孔隙&=
#20869;的一切微生物或生 =
289;体，即把所有生命的=
;物质全部杀死。
5=
0;毒：指杀死、消除或&=
#20805;分抑制部分微生物A=
292;使之不再发生危害作=
;用，即一些不会完全&#=
26432;死，还有活着的微ī=
83;物。
6ਰ=
0;菌操作：在通过严格&=
#28781;菌的操作空间（接 =
181;室、超净台等）和使=
;用的器皿内，以及操&#=
20316;者外表都不带任何ė=
63;着的微生物条件下，=
进行操作叫做无菌操=
0316;。
7ಭ=
2;培无菌的要求：必须&=
#24443;底无菌，比微生物=
521;养还严格，因为培养=
;基营养丰富，温度和&#=
28287;度等合适。要彻底ğ=
81;菌，必须根据不同的=
对象采取不同的切实=
6377;效的方法灭菌。
8ା=
1;菌方法可分为物理的&=
#21644;化学的两类：
(1)୰=
9;理方法：如干热（烘&=
#28903;和灼烧）、湿热（=
120;压或高压蒸煮）、射=
;线处理（超声波、微&#=
27874;）、过滤、清洗和Ą=
80;菌水冲洗等措施。
(2)ࡏ=
0;学方法：升汞、甲醛&=
#12289;过氧化氢、高锰酸&=
078;、来苏儿、漂白粉、=
;次氯酸钠、抗菌素、&#=
37202;精等。
一．培养&#=
22522;用湿热灭菌
培养基在&#=
21046;备后的24小时内完成灭ő=
40;工序。
1ོ=
0;压灭菌原理ᦂ=
6;在0.1MPa的压力下，锅&=
#20869;温度达
2=
5;证高压ᦂ=
6;1)注意完全排除&#=
31354;气，常用方法是：&=
#20851;闭放气阀，通电后A=
292;待压力上升到0.05MPa时，打开放气=
阀，放出空气，待压=
1147;表指针归零后，再ࠥ=
1;闭放气阀。2)保压到位，维&=
#25345;压力0.1～0.15MPa 20minz=
90;
因容器不&#=
21516;，保压时间而不同
表4－１á=
21;养基高压蒸气灭菌所=
必需的最少时间
|
容Ý=
20;的体积（ml） |
在ʌ=
97;２１０Ｃ灭菌所Ƃ=
56;最少时间（min） |
|
２ʌ=
96;～５０ |
１５ |
|
７ʍ=
01;～１５０ |
２０ |
|
２ʍ=
01;０～５００ |
２５ |
|
１ʌ=
96;００ |
３０ |
培养基要&#=
20005;格遵守保压时间，Ą=
82;要保压彻底，又要防=
止培养基中的成分变=
6136;或效力降低，不能༎=
3;意延长时间。
3对其它=
9289;品灭菌ᦂ=
6;无菌水、栽培介质、&=
#25509;种用具、滤纸、实'=
564;服、口罩等，可以延=
;长灭菌时间或提高压&#=
21147;。这些物品用耐高Õ=
87;塑料袋装好，或用引=
报纸或牛皮纸包好。
4引起变化：培养基pH值下降0.2～0.3 单位。培养基中= 成分单一时pH值变化幅&#= 24230;较大，甚至可大于2个= pH单位；升高渗透= 压：因铁使蔗糖水解= 0026;单糖，占15％～25％，约升&#= 39640;0.43倍。= PH值小和加&#= 20837;活性碳，蔗糖水解â= 86;加。
二=
.无菌操作器械采用=
8796;烧灭菌
对镊子、剪子、=
解剖刀、瓶口等用灼=
8903;灭菌。若浸入95%的酒精中，然=
518;再灼烧，效果更好。=
;灼烧要完全彻底。
三=
.玻璃器皿及耐热用=
0855;采用干热灭菌
1原理：利&#=
29992;烘箱加热到160～180０Ｃ的温度来杀死微生=
;物，通常采用170０Ｃ持续90min来灭菌。由于&#=
22312;干热条件下，细菌į=
40;营养细胞的抗热性大=
为提高，接近芽孢的=
5239;热水平，
2ࣦ=
8;理：先洗净并干燥，&=
#23545;工具等要用耐高温 =
340;塑料妥为包扎；灭菌=
;时应渐进升温；烘箱&#=
20869;放置的物品的数量Ç=
81;宜过多；到时断电要=
待充分冷凉，
3୲=
5;点：耗能源，费时间&=
#12290;成本较低。
=
四 不耐&#=
28909;的物质采用过滤灭ő=
40;
1适用种类&#=
65306;赤霉素、玉米素、Ŋ=
73;落酸和某些维生素由=
于不耐热，可用过滤=
7861;。
2过滤方法&#=
65306;防细菌滤膜的网孔ô=
52;为0.45μm以下&#=
65292;细菌的细胞和真菌į=
40;孢子等因大于孔径而=
被阻，液量大时，常=
0351;用抽滤装置；液量ऴ=
7;时，可用注射器。
五.空间ğ=
81;菌采用紫外线和熏蒸=
灭菌
1.಄=
3;外线灭菌
1)=
6;宜：接种室、超净台&=
#30340;空间。只适于空气=
644;物体表面的灭菌
2)=
7;理：细菌吸收紫外线&=
#21518;，蛋白质和核酸发 =
983;结构变化，引起细菌=
;的染色体变异，造成&#=
27515;亡。
3)୲=
5;点：紫外线的波长为<=
span
lang=3DEN-US>200～300nm，Ð=
54;中以260nm的杀菌能力最&#=
24378;，但是紫外线的穿Ű=
79;物质的能力很弱，所=
以只适于表面灭菌，=
9988;要求距照射物以不ฦ=
9;过
2.=
1;蒸灭菌
‘
1)ઍ=
0;念：用加热焚烧、氧&=
#21270;等方法
，使化学药剂变为气=
0307;状态扩散到空气中ᦁ=
2;以杀死空气和物体表&=
#38754;的微生物。这种方=
861;简便，只需空间关闭=
;紧密。
2)=
7;理：使微生物的蛋白&=
#36136;变性，或竞争其酶 =
995;统，或降低其表面张=
;力，增加菌体细胞浆&#=
33180;的通透性，使细胞ij=
72;裂或溶解。
3)୲=
5;点：一般说来，温度&=
#36234;高，作用时间越长A=
292;杀菌效果越好。浓度=
;越大，杀菌能力越强&#=
65292;但石炭酸和酒精例ä=
06;。另外，消毒剂必须=
制成水溶状态。墙壁=
0808;喷湿会加强效果。=
1;间要关闭紧密。
4)药品：=
4120;用熏蒸剂是甲醛,熏蒸时，按5～8ml/m3用量，加
=
6.一些物=
4920;用药剂喷雾或擦拭ା=
1;菌
物体表=
8754;可用一些药剂涂擦ӌ=
9;喷雾灭菌。如桌面、&=
#22681;面、双手、植物材=
009;表面等，可用70％的酒精反复Ę=
34;擦灭菌，１％～２％=
的来苏儿溶液以及0.25～１％的新洁=
3572;灭也可以。
7. 植物材=
6009;表面用消毒剂灭菌
ઁ=
3;物材料必须经严格的&=
#34920;面灭菌处理，再经=
080;菌操作手续接到培养=
;基上，这一过程叫做&#=
25509;种。接种的植物材Ą=
09;叫做外植体。
=
2;一步是清洗
把材料切割成适当大=
3567;，即灭菌容器能放ࠣ=
7;为宜。置自来水龙头&=
#19979;流水冲洗几分钟至=
968;小时，易漂浮或细小=
;的材料，可装入纱布&#=
34955;内冲洗。洗时可加Ð=
37;洗衣粉或表面活性物=
质－吐温助洗，最后=
9992;自来水冲净。
第二步=
6159;表面浸润。严格要=
;求要在超净台内完成&#=
65292;准备好消毒的烧杯z=
89;玻璃棒、70%酒精、消毒液=
289;无菌水、手表等。用=
;70%酒精浸30=
秒左右。
作用：=
0351;植物材料表面被浸ଌ=
7;。但要把握时间。70%酒精穿透力强A=
292;对特殊的材料，如果=
;实、花蕾、包有苞片&#=
12289;苞叶等的孕穗，多ì=
18;鳞片的休眠芽等，以=
及主要取用内部的材=
6009;，可处理稍长一些Ӎ=
0;
第三步是
表4-2 常用灭菌剂使=
9992;浓度及效果比较表
|
灭ő=
40;剂 |
使ī=
92;浓度 |
持ń=
93;时间(min) |
去Ɓ=
00;的难易 |
效ĉ=
24; |
|
次Ĕ=
95;酸钙 |
9～10% |
5～30 |
易 |
很å=
09; |
|
次Ĕ=
95;酸钠 |
2% |
5～30 |
易 |
很å=
09; |
|
氯Ô=
70;汞 |
0．1～1% |
5～8 |
较Ɓ=
90; |
最å=
09; |
|
抗ő=
40;素 |
4～50mg/=
L |
30～60 |
中 |
较å=
09; |
次氯酸钠&#=
21644;次氯酸钙在使用前È=
20;时配制，都是利用其=
分解产生氯气来杀菌=
5292;故灭菌时用广口瓶ࡃ=
2;盖较好；灭菌效果次&=
#20110;氯化汞，得易于去&=
500;。
氯化汞可&#=
30701;期内贮用。氯化汞È=
63;称升汞，为剧毒物质=
，它由重金属汞离子=
0772;坏微生物蛋白质等=
9;达到灭菌目的；特点&=
#26159;灭菌效果好，得去&=
500;残毒较难，应当用无=
;菌水涮洗8～10次，&#=
27599;次不少于3min，
过氧化氢&#=
26159;分解中释放原子态Ĕ=
87;来杀菌的，这种药剂=
残留的影响较小，灭=
3740;后用无菌水涮洗3～4次即=
1487;；而
灭菌作法&#=
65306;=
3;干的植物材料转到๙=
9;大器皿中，倒入消Ĕ=
02;液开始记时，并不断=
用玻璃棒轻轻搅动A=
292;以驱除气泡促进接触=
;和消毒彻底。用倾倒=
;法灭菌液要充分浸=
7809;材料。
ା=
1;菌液中可加吐温-80或Triton X，&#=
20351;药剂更易于展布和Ę=
24;入到的材料表面。一=
般加入灭菌液的0.5%，即在100ml加入15滴。
最后一步&#=
26159;用无菌水涮洗，߯=
6;用是免除消毒剂杀伤&=
#26893;物细胞的副作用。 =
078;洗要每次3min左右，视情况=
5292;涮洗3～10次左&#=
21491;。
接种时由于有一=
个敞口的过程，所以=
6159;极易引起污染的时=
9;，这一时期主要由空&=
#27668;中的细菌和工作人=
592;本身引起，接种室要=
;严格进行空间消毒。&#=
25509;种室内保持定期用1-3%的高锰酸钾溶=
8082;对设备、墙壁、地ਖ਼=
5;等进行擦洗。除了使&=
#29992;前用紫外线和甲醛 =
781;菌外，还可在使用期=
;间用70%的酒精或3=
%的来苏儿喷雾，使=
1354;气中灰尘颗粒沉降ߍ=
9;来。工作人员进入接&=
#31181;室前双手必须进行=
905;净，先用水和肥皂洗=
;涤，操作前再用70%酒精擦试，操=
316;时双手不能随便接触=
;未经消毒的东西。入&#=
23460;前穿好灭菌的专用ê=
54;验服和换托鞋，专用=
实验服要经常保持清=
7905;并消毒。头发带的ା=
4;尘也很多，因此应戴&=
#19978;专用帽子。工作人=
592;的呼吸也是污染的主=
;要途径，操作规程过&#=
31243;禁止不必要的谈话Ø=
44;咳嗽，可带上口罩。=
还要尽量减少工作人=
1592;在接种室内的走动Ӎ=
0;
操作期间
৶=
9;种是将已消毒好的根&=
#12289;茎、叶等离体器官A=
292;经切割或剪裁成小段=
;或小块，放入培养基&#=
30340;过程。以上已叙述ÿ=
09;种前的材料表面的消=
毒灭菌，现将接种前=
1518;的程序连贯地介绍Ӎ=
0;
(ߌ=
8;)将初步洗涤及࠳=
9;割的材料放入烧杯，&=
#24102;入超净台上，用消=
602;剂灭菌，再用无菌水=
;冲洗．最后沥去水分&#=
65292;取出放置在灭过菌į=
40;４层纱布上或滤纸上=
。
（二）材&#=
26009;吸干后，一手拿镊é=
76;，一手拿剪子或解剖=
刀，对材料进行适当=
0340;切割。如叶片切成
ᦀ=
8;三）用灼烧消毒过的&=
#22120;械将切割好的外植=
307;插植或放置到培养基=
;上。具体操作是：先&#=
35299;开包口纸，将试管Ñ=
60;乎水平拿着，试管口=
靠近酒精灯火焰，将=
1649;口在火焰上方转动ᦁ=
2;让管口里外灼烧数秒&=
#38047;，若用棉塞盖口，=
487;先在管口外面灼烧，=
;去掉棉塞，再烧管口&#=
37324;面。然后用镊子夹Ö=
62;一块切好的外植体送=
入试管内，轻轻插入=
2521;养基上。若是叶片=
2;接附在培养基上，以&=
#25918;1～3块为=
3452;。至于材料放置方ૢ=
1;除茎尖、茎段要正放&=
#65288;尖端向上）外，其=
427;尚无统一要求。放置=
;材料数量现在倾向少&#=
25918;，通过统计认为：ë=
45;外植体每次接种以一=
支试管放一枚组块为=
3452;，这样节约培养基ࡴ=
4;人力，一旦培养物污&=
#26579;可以抛弃。接完种=
518;，将管口在火焰上再=
;灼烧数秒钟。若用棉&#=
22622;，塞好后，包上包Ö=
75;纸，包口纸里面也要=
过火。
指把培养&#=
26448;料放在培养室（有Ð=
09;照、温度条件）里，=
使之生长，分裂、分=
1270;形成愈伤组织或进ߌ=
8;步分化成再生植株的&=
#36807;程。
ᦀ=
8;一）培养方法
1ᦁ=
4;固体培养法
即用琼脂固化培=
养基来培养植物材料=
0340;方法。是现在最常ஷ=
2;的方法
。该法设备简单，易=
4892;。但养分分布不均ᦁ=
2;生长速度不均衡。并&=
#24120;有褐化中毒现象发 =
983;。
2ᦁ=
4;液体培养法
即用不加&#=
22266;化剂的液体培养基á=
21;养植物材料的方法。=
由于液体中氧气含量=
6739;少，常需要通过搅ࡄ=
0;或振动培养液的方法&=
#20197;确保氧气的供给，%=
319;用往复式摇床或旋转=
;式摇床进行培养，其&#=
36895;度一般为50～100转／=
min，这种定期浸=
809;的方法，既能使培养=
;基均一，又能保证氧&#=
27668;的供给。
ᦀ=
8;二）培养步骤
1ᦁ=
4;初代培养
ࡘ=
3;接种某种外植体后，&=
#26368;初的几代培养。初=
195;培养旨在获得无菌材=
;料和无性繁殖系。初&#=
20195;培养时，常用诱导û=
10;分化培养基，即培养=
基中含有较多的细胞=
0998;裂素和少量的生长ಃ=
2;。初代培养建立的无&=
#24615;繁殖系包括茎梢、!=
469;丛、胚状体和原球茎=
;等。根据初代培养时&#=
21457;育的方向可分为：
（1）顶芽和腋芽的发育
采用外源&#=
30340;细胞分裂素，可促Ë=
51;具有顶芽或没有腋芽=
的休眠侧芽启动生长=
2290;形成一个微型的多ੜ=
5;多芽的小灌木丛状的&=
#32467;构。在几个月内可=
197;将这种丛生苗的一个=
;枝条转接继代，重复&#=
33469;－苗增殖的培养，É=
74;而迅速获得多数的嫩=
茎。然后将一部份嫩=
3550;转移到生根培养基ߍ=
8;，就能得到可种植到&=
#22303;壤中去的完整的小=
893;株。一些木本植物和=
;少数草本植物可以通&#=
36807;这种方式来进行再ī=
83;繁殖，如月季、茶花=
、菊花、香石竹等等=
2290;这种繁殖方式也称߯=
6;微型扦插，它不经过&=
#21457;生愈伤组织而再生A=
292;是最能使无性系后代=
;保持原品种特性的一&#=
31181;繁殖方式。
适宜这种&#=
20877;生繁殖的植物，在ŵ=
19;样时，只能采用顶芽=
、侧芽或带有芽的茎=
0999;段，其它如种子萌ࡡ=
7;后取枝条也可以。
茎尖培养&#=
21487;看作是这方面较为ĥ=
05;殊的一种方式。它采=
用极其幼嫩的顶芽的=
3550;尖分生组织作为外ઁ=
3;体进行接种。在实际&=
#25805;作中。采用包括茎=
574;分生组织在内的一些=
;组织来培养，这是为&#=
20102;操作方便以及容易û=
04;活。
用靠培养&#=
23450;芽得到的培养物一ō=
24;是茎节较长，有直立=
向上的茎梢，扩繁时=
0027;要用切割茎段法，ࣳ=
4;香石竹、矮牵牛、菊&=
#33457;等。但特殊情况下=
063;会生出不定芽，形成=
;芽丛。
ᦀ=
8;2）不定芽的发ೞ=
6;
在培养中&#=
30001;外植体产生不定芽,通常首先要经೫=
3;分化过程,形成愈伤组织=
0;细胞。然后，经再分&=
#21270;，即由这些分生组 =
455;形成器官原基，它在=
;构成器官的纵轴上表&#=
29616;出单向的极性（这Ç=
82;胚状体不同）。多数=
情况下它先形成芽，=
1518;形成根。
另一种方&#=
24335;是从器官中直接产ī=
83;不定芽，有些植物具=
有从各个器官上长出=
9981;定芽的能力如矮牵୯=
5;、福禄考、悬钩子等&=
#12290;当在试管培养的条=
214;下，培养基中提供了=
;营养，特别是连续不&#=
26029;植物激素的供应，Ë=
51;植物形成不定芽的能=
力被大大地激发起来=
2290;许多种类的外植体ඤ=
0;面几乎全部为不定芽&=
#25152;覆盖。许多常规方=
861;不能无性繁殖的种类=
;，在试管条件下却能&#=
36739;容易地产生不定芽Ň=
80;再生，如柏科，松科=
，银杏等一些植物。=
5768;多单子叶植物储藏ࢤ=
0;官能强烈地发生不定&=
#33469;，用百合鳞片的切=
359;就可大量形成不定鳞=
;茎。
在不定芽&#=
22521;养时，也常用诱导û=
10;分化培养基。用靠培=
养不定芽得到的培养=
9289;，一般采用芽丛进ඡ=
2;繁殖，如非洲菊、草&=
#33683;等。
（3）߮=
7;细胞胚状体的发生与&=
#21457;育
߮=
7;细胞胚状体类似于合&=
#23376;胚但又有所不同，=
427;也通过球形，心形，=
;鱼雷形和子叶形的胚&#=
32974;发育时期，最终发ʼn=
46;成小苗。但它是由体=
细胞发生的。
胚状体可以从愈伤组=
2455;表面发生，也可从ࣨ=
6;植体表面已分化的细&=
#32990;产生，或从悬浮培=
859;的细胞产生。
(4)初代培养外植体= 的褐变
外植= 体褐变是指在接种后= 5292;其表面开始变褐，੍= 7;时甚至会使整个培养&= #22522;变褐的现象。它的= 986;现是由于植物组织中= ;的多酚氧化酶被激活&#= 65292;而使细胞的代谢发ī= 83;变化所致。在褐变过= 程中，会产生醌类物= 6136;，它们多呈棕褐色ᦁ= 2;当扩散到培养基后，&= #23601;会抑制其他酶的活= 615;，从而影响所接种外= ;植体的培养。
褐变的主要原因如Ç= 79;：
（1）花卉品种：研= 究表明，在不同花卉= 1697;种间的褐变现象是ߎ= 1;同的。由于多酚氧化&= #37238;活性上的差异，因= 492;有些花卉品种的外植= ;体在接种后较易褐变&#= 65292;而有些花卉品种的ä= 06;植体在接种后不易褐= 变。故在培养过程中= 4212;该有所选择，对不ࡧ= 6;的品种分别进行处理&= #12290;
（2）生理状态：外= 植体的生理状态不同= 5292;在接种后褐变程度ߖ= 3;有所不同。一般来说&= #65292;处于同期的植物材= 009;褐变程度较浅，而从= ;已经成年的植株采收&#= 30340;外植体，由于含醌ľ= 67;物质较多，因此褐变= 较为严重。一般来说= 5292;幼嫩的组织在接种ࡧ= 8;褐变程度并不明显，&= #32780;老熟的组织在接种= 518;褐变程度较为严重。= ;
（= 3）培养基成分：= 浓度过高的无机盐会= 0351;某些观赏植物的褐ࡢ= 4;程度增加，此外，细&= #32990;分裂素的水平过高= 063;会刺激某些花卉外植= ;体的多酚氧化酶的活&#= 24615;，从而使褐变现象Ó= 52;深。
（4）培养条件不当= ：例如光照过强、温= 4230;过高、培养时间过= 1;等，均可使多酚氧化&= #37238;的活性提高，从而= 152;速被培养的外植体的= ;褐变程度。
为了提高花卉组= 织培养的成苗率，必= 9035;对外植体的褐变现ฉ= 7;加以控制。经过众多&= #30740;究者的努力，可以%= 319;用措施防止、减轻褐= ;变现象的发生。
（1）选择合适的外= 植体：一般来说，最= 2909;选择生长处于旺盛= 0;外植体，这样可以使&= #35088;变现象明显减轻。
（2）合适的培养条= 件：无机盐成分、植= 9289;生长物质水平、适ऩ= 2;温度、及时继代培养&= #22343;可以减轻材料的褐= 464;现象。
（3）使用抗氧化剂= ：在培养基中，使用= 1322;胱氨酸、抗坏血酸= 1;抗氧化剂能够较为有&= #25928;地避免或减轻很多= 806;植体的褐变现象。另= ;外使用0．= 1％～0．5％的活性炭对防= 止褐变也有较为明显= 0340;效果。
（4）连续转移：对=
容易褐变的材料可间=
8548;12～=
24小时的培养后，=
再转移到新的培养基=
9978;，这样经过连续处ச=
2;7～=
10天后，褐变现象=
便会得到控制或大为=
0943;轻。
2．继代培养
ࢷ=
2;初代培养的基础上所&=
#33719;得的芽、苗、胚状=
307;和原球茎等,数量都还不多ᦁ=
2;它们需要进一步增殖&=
#65292;使之越来越多，从 =
780;发挥快速繁殖的优势=
;。
ರ=
7;代培养是继初代培养&=
#20043;后的连续数代的扩 =
321;培养过程。旨在繁殖=
;出相当数量的无根苗&#=
65292;最后能达到边繁边ī=
83;根的目的。继代培养=
的后代是按几何级数=
2686;加的过程。如果以2株苗为基础，=
7;么经10代将生成2<=
sup>10株苗。
ರ=
7;代培养中扩繁的方法&=
#21253;括：切割茎段、分 =
163;芽丛、分离胚状体、=
;分离原球茎等。切割&#=
33550;段常用于有伸长的ŏ=
50;梢、茎节较明显的培=
养物。这种方法简便=
6131;行，能保持母种特ঝ=
5;。培养基常是MS0基本培养基&=
#65307;分离芽丛适于由愈=
260;组织生出的芽丛。培=
;养基常是分化培养基&#=
12290;若芽丛的芽较小。Ö=
87;先切成芽丛小块，放=
入MS0培养基中，&=
#24453;到稍大时，再分离=
320;来继续培养。
ࣜ=
6;殖使用的培养基对于&=
#19968;种植物来说每次几=
046;完全相同，由于培养=
;物在接近最良好的环&#=
22659;条件，营养供应和Ğ=
08;素调控下，排除了其=
它生物的竞争，所以=
3021;够按几何级数增殖Ӎ=
0;
ࢷ=
2;快速繁殖中初代培养&=
#21482;是一个必经的过程A=
292;而继代培养则是经常=
;性不停的进行过程。&#=
20294;在达到相当的数量È=
43;后，则应考虑使其中=
一部分转入生根阶段=
2290;从某种意义上讲，ࣜ=
6;殖只是贮备母株，而&=
#29983;根才是增殖材料的=
998;流，生产出成品。
1)ರ= 7;代培养时材料的玻璃化
实践表明，当植= 物材料不断地进行离= 0307;繁殖时，有些培养୰= 9;的嫩茎、叶片往往会&= #21576;半透明状，呈水迹 = 366;，这种现象通常称为= ;玻璃化。它的出现会&#= 20351;试管苗生长缓慢、Ń= 21;殖系数有所下降。玻= 璃化为试管苗的生理= 2833;调症。
出现玻璃化的嫩= 茎不宜诱导生根，因= 7492;使繁殖系数大为降߮= 2;。在不同的种类、品&= #31181;间，试管苗的玻璃= 270;程度也有所差异，当= ;培养基上细胞分裂素&#= 27700;平较高时，容易出Ĩ= 16;玻璃化现象。在培养= 基中添加少量聚乙烯= 7255;、脱落酸等物质，೦= 1;够在一定程度上减轻&= #29627;璃化的现象发生。
呈现玻璃化的试= 管苗，其茎、叶表面= 6080;蜡质，体内的极性ࡏ= 0;合物水平较高，细胞&= #25345;水力差，植株蒸腾= 316;用强，无法进行正常= ;移栽。这种情况主要&#= 26159;由于培养容器中空Ĕ= 68;湿度过高，透气性较= 差造成的，其具体解= 0915;的方法为：
（1）增加培&#= 20859;基中的溶质水平，É= 97;降低培养基的水势；=
（2）减少培&#= 20859;基中含氮化合物的ī= 92;量；
（3）增加光照；<= /p>
（4）增加容器通风= ，最好进行CO2施肥= ，这对减轻试管苗玻= 9827;化的现象有明显的߯= 6;用；
（5）降低培养温度= ，进行变温培养，有= 1161;于减轻试管苗玻璃ࡏ= 0;的现象发生；
（6）降低培养基中细= 胞分裂素含量，可以= 2771;虑加入适量脱落酸Ӎ= 0;
3ᦁ=
4;生根培养
ঈ=
3;材料增殖到一定数量&=
#21518;，就要使部分培养 =
289;分流到生根培养阶段=
;。若不能及时将培养&#=
29289;转到生根培养基上ʌ=
92;就会使久不转移的苗=
子发黄老化，或因过=
0998;拥挤而使无效苗增ࣩ=
0;造成抛弃浪费。因此&=
#29983;根培养是使无根苗 =
983;根的过程。最后要使=
;生出的不定根浓密而&#=
31895;壮。生根可采用1/2或者１／４MS培养基，全部去&=
#25481;细胞分裂素，并加=
837;适量的生长素(NAA、IBA等)。
ஷ=
2;下列方法诱导生根（<=
span
lang=3DEN-US>1）将新梢基部=
4;入50或100ppm IBA溶&=
#28082;中处理4～8小时=
2290;（2）在含有生长ಃ=
2;的培养基中培养4～6天。=
5288;3）直接移入含੍=
7;生长素的生根培养基&=
#20013;。上述三种方法均!=
021;诱导新梢生根。但前=
;二种方法对新生根的&#=
29983;长发育更有利。而Ļ=
32;三种对幼根的生长有=
抑制作用。因为当根=
1407;始体形成后较高浓ॷ=
0;生长素的继续存在，&=
#21017;不利于幼根的生长=
457;育。但这种方法比较=
;可行。
੍=
7;时采用下列方法就可&=
#29983;根。（1）延长在增殖࣌=
1;养基中的培养时间。&=
#65288;2）有意降低一ߜ=
3;增殖倍率，减少细胞&=
#20998;裂素的用量（即将=
686;殖与生根合并为一步=
;）。（3）切割粗壮的ग=
3;枝在营养钵中直接生&=
#26681;，即没有生根阶段=
290;第三种方法省去了一=
;次培养基制作。切割&#=
19979;的插穗可用生长素ě=
42;液浸蘸处理，但这往=
往适于一些容易生根=
0340;作物。
少数植物&#=
29983;根比较困难的，需Š=
01;在培养基中放置滤纸=
桥，使其略高于液面=
5292;靠滤纸的吸水性供ॵ=
2;水和营养等，从而诱&=
#21457;生根。
ߡ=
4;胚状体发育成的小苗&=
#65292;常常有原先即已分=
270;的根，可以不经诱导=
;生根阶段。但因经胚&#=
29366;体途径发育的苗数ĥ=
05;别多，且个体较小，=
所以也常需要一个低=
7987;度或没有植物激素=
0;培养基培养的阶段，&=
#20197;便壮苗生根。
=
7;管内生根壮苗的阶段&=
#65292;目的是为了成功地 =
227;植到试管外的环境中=
;，使试管苗适应外界&#=
30340;环境因子。不同植Ĥ=
89;的适宜驯化温度不同=
。如菊花，以18～20０Ｃ为宜。温度过高牵&=
#28041;到蒸腾加强。以及!=
740;类易滋生等问题。温=
;度过低使幼苗生长迟&#=
32531;，或不易成活．春é=
95;低温时苗床可加设电=
热线使基质温度略高=
0110;气温2～3０=
Ｃ，这利于生根和促=
6827;根系发达，有利于৻=
2;前成活。
ࠠ=
9;强应比以前培养有所&=
#25552;高。以强度较高的 =
459;射光为好，约4000Lx左右为宜，以&=
#32500;持光合作用所需光=
378;。但光线过强刺激蒸=
;腾加强，使水分平衡&#=
30340;矛盾更尖锐。
二、试管苗移栽=
ཱ=
5;化
驯化概念：植物= 由一种生长环境转到= 1478;一种差异较大的生= 1;环境的适应过程。如&= #24341;进一种植物先要对= 854;进行驯化。
ཱ= 5;化原因：试管苗是在无菌= 、有营养供给、适宜= 0809;照和温度及近乎100%的相= 对湿度相对优越的环= 2659;条件下生长的。在ஶ= 3;理、形态等方面都与&= #33258;然条件生长的正常= 567;苗有很大差异。
主要驯化障碍：= 即湿度，试管苗叶片= 5282;质层不发达，叶片= 0;常没有表皮毛，或仅&= #26377;较少表皮毛。叶片= 978;甚至出现了大量的水= ;孔，此外，气孔的数&#= 37327;、大小也往往超过Ć= 22;通苗。当将它们直接= 移栽到自然环境中，= 5797;管苗蒸滕作用极大ᦁ= 2;失水率很高，非常容&= #26131;死亡。
驯化措施：
先是通过增加小= 环境湿度、减弱光照= 2289;降低温度等变化，= 2;后逐渐降低湿度、增&= #21152;光照、增加温度至!= 258;然状态。通过这样的= ;湿度由高至低、光照&#= 30001;弱至强、温度由低Ō= 67;高的炼苗过程，使它= 们在生理、形态、组= 2455;上发生相应的变化ᦁ= 2;逐渐地适应外界的自&= #28982;环境。
（一）移栽使用的á= 22;质和容器
基质具备特点：要Ð=
55;备透气性、保湿性和=
一定的肥力，ब=
1;易灭菌处理，不利于&=
#26434;菌滋生。常选用珍 =
664;岩、蛭石、河砂、=
草炭等。
1.ஔ=
5;珠岩
来源：是&#=
21547;硅的矿物质在炉体È=
13;加热到
特点：一&#=
33324;80
使用：珍珠í= 21;一般不单独使用多与= 其它基质混合使用，= 1333;独使用时因质轻，૭= 5;水过猛易漂浮，不利&= #20110;根系固定。如珍珠= 721;与泥炭等量混合。
2. ൾ=
1;石
来源：为&#=
20113;母类次生矿物，在1000炉体中加热膨=
2960;，形成多孔的海绵=
6;物体，
特点：蛭&#=
30707;质地较轻，每立方ľ=
59;96
使用：育&#=
33495;时可过筛使用。可É=
97;单独使用。
|
几种常见=
基质的物理性状 |
||||
|
基ũ=
36; |
容ŵ=
25;(g/cm3) |
总é=
80;隙度% |
大é=
80;隙% |
小é=
80;隙% |
|
河ij=
22; |
1.49 |
30.5 |
29.5 |
45.0 |
|
蛭ij=
07; |
0.13 |
95.0 |
30.0 |
65.0 |
|
珍Ĩ=
64;炭 |
0.16 |
93.2 |
53.0 |
40.2 |
|
泥Ġ=
45; |
0.21 |
84.4 |
7.1 |
77.3 |
3．河砂
特点；取材方便=
，资源丰富，成本低=
5292;透气性好，排水性অ=
8;，但砂子容重大(1.5
使用：一般不单=
独用来直接栽种试管=
3495;。一般选用粒径为0.5
4．草炭
草炭又称泥炭，= 是由沉积在沼泽中的= 6893;物残骸经过长时间= 0;腐烂所形成。草炭质&= #22320;细腻，持水和保水!= 021;力强，但通常通透性= ;较差，泥炭富含有机&#= 36136;和营养物质，具有ů= 39;强的缓冲能力。草炭= 用作基质，管理方便= 5292; 成功率高&#= 65292;但通常不能单独用Ĉ= 69;栽种试管苗，宜与其= 它基质混合形成复合= 2522;质，从而充分发挥ࡦ= 8;自的优势，弥补其不&= #36275;。
5．腐殖土
来源：是由植物= 落叶经腐烂所形成。= 3104;叶上含有大量的矿ฝ= 6;营养、有机物质。
特点：性质和草= 炭相似，
使用：它通常不= 单独使用。掺有腐殖= 2303;的栽培基质有助于ઁ= 3;株发根。
复合基质的使用=
一般用珍&#=
29664;岩：蛭石：草炭土û=
10;腐殖土为1：1：0.5。也可用砂子：=
草炭土或腐殖土为1：1。
基质在使&#= 29992;前应灭菌。少量用ƌ= 40;压灭菌，多时用烘烤= 、蒸气、药物等方法
੬=
5;培容器：可用大型栽&=
#22521;槽，可用6×6～10×
ᦀ=
8;二）移栽前练苗 移&=
#26685;前将培养物不开口 =
227;到自然光照下锻练2－3天，=
8982;后开口练苗1－2天。
（三）移栽和幼=
苗的管理
1移栽：从试管用= 镊子取出发根的小苗---冲洗= 掉根部粘着的培养基---用竹= 签在基质中插孔---然后= 将小苗插入----栽后= 把苗周围基质压实---栽后= 轻浇薄水。
注意：幼苗较嫩，ƀ= 50;止弄伤。栽前基质要= 浇透水。 栽后移入&#= 39640;湿度的环境中，保ť= 77;空间湿度达90%以上= 。
2管理：
1) 保持小苗的水&= #20998;供需平衡。
原则：移栽后5－7天内= 5292;保持较高的空气湿ॷ= 0;，接近培养瓶的条件&= #12290;当5－7天后= 5292;发现小苗有生长趋ࡆ= 3;，可逐渐降低湿度，&= #35753;小苗始终保持挺拔 = 340;状态。
做法：营养钵的培养= ;基质要浇透水，所放&#= 32622;的床面也要浇湿，搭设小拱棚，ॲ= 2;且初期要常喷雾处理&= #65292;保持拱棚薄膜ߍ= 8;有水珠出现。后期减&= #23569;喷水次数，将拱棚= 004;端打开通风，使小苗适应湿ॷ= 0;较小的条件。约15天以后揭去拱Č= 42;的薄膜，并逐渐减少= 浇水，促进小苗长得= 1895;壮。
2)防止菌类滋生&#=
12288;
原则：因试管苗原= 来是无菌的，加之驯= 1270;条件湿润易生杂菌ᦁ= 2;应尽量不使菌类大量&= #28363;生。
做法：如对基质进行=
;灭菌。对幼苗喷洒杀&#=
33740;剂，如多菌灵、托ð=
67;津，
每7－10=
825;一次。在移苗时尽量=
;少伤苗。喷水时可加&#=
20837;0.1%的尿素，或用
=
3一定的温、光条件=
2288;
原则=
5306;适宜的生根温度是
做法ᦂ= 6;冬春季地温较低时，&= #21487;用电热线来加温。= 312;小拱棚上加盖遮阳网= ;或报纸等，后期当小&#= 26893;株有了新的生长时ʌ= 92;逐渐加强光照，至直= 接利用自然光照。
4=
5;持基质适当的通气性<=
/span>ᦁ=
2;要选择适当的颗粒状&=
#22522;质，保证良好的通=
668;作用。管理过程中不=
;要浇水过多，过多的&#=
27700;应能迅速沥除，以Ò=
33;根系呼吸。
只要把水&#=
20998;平衡、适宜的介质z=
89;控制杂菌和适宜的光=
、温条件控制好，试=
1649;苗是很容易移栽的Ӎ=
0;
由于试管苗在接= 近理想的条件下生长= 0998;化，已不受季节限࠸= 6;，有人为提供的外源&= #26893;物激素的促进，增= 542;的速度是很快的。通= ;常按接种的繁殖体块&#= 25968;，或按培养瓶计算ų= 17;可以，经过几个周期= 的培养，看看能得到= 2810;少块中间繁殖体，= 0;得到了多少瓶繁殖体&= #65292;这两种方法都比较= 934;确。但不能简单地按= ;接种1个芽，培&#= 20859;后能数出多少个芽Ĉ= 69;计算，应按能再切出= 多少块供再接种的材= 6009;来计算。有了每一ࡰ= 8;期（从接种当天到再&= #27425;可供接种的当天）&= 656;要多少天，每周期每= ;一瓶能接种多少瓶，&#= 65288;每周期都能稳定地ů= 98;到）每瓶有多少苗，= 这几个基本数字，就= 1487;以根据几何增加的= 7;理，按下面简单的公&= #24335;计算出年增殖率的 = 702;论值：
年增殖率：y；每周期&#= 22686;殖的倍数：x；
全年可增殖的周= 期数：n＝= 365／每周期的天数= ；
y＝xn
从这一公式可以= 看出，培养周期愈短= 2289;每次增殖的倍数愈ོ= 0;，年增殖总倍数就更&= #39640;。只要每年能增殖8～= 10次，每次增殖<= span lang=3DEN-US>3～= 4倍以上，就可满= 足快速繁殖的要求了= 2290;
&n=
bsp;
如果从
第四节 快速繁殖ð=
37;作的计划安排
首先要限制增殖的ī= 42;数，存架增殖总瓶数= (T)不应= 过多过少，如盲目增= 7542;，一段时间后就会ࢰ= 0;缺乏人力或设备，处&= #29702;不了后续的工作，= 351;增殖材料积压，一部= ;分苗子老化，超过最&#= 20339;接转继代的时期，Ű= 96;成生根不良、生长势= 减弱、增殖倍率降低= 1561;等不利后果。增殖ல= 2;数不足，会造成母株&= #25968;不够用，也会延误= 135;苗。= 1482;要适当增加比例，1个周期不到就能纠Ē= 91;过来。 存架增殖总瓶数ᦀ= 8;T）= =3D增殖周期内工作= 日数W×每工作= 6085;需用的母株瓶数S。=
举例来说，在矮牵Ĥ=
75;扩繁中
每天有
为=
25×1200=3D30,000
其次是考虑每天接ķ= 81;增殖与生根的比例<= span lang=3DEN-US> 需按实际情况试= 做后确定，一般为3：= 7，通过培养基中= 植物激素的用量、糖= 7987;度、培养温度等条ߥ= 4;也可加以调整。增殖&= #20493;率高的，生根的比= 363;大，每工作日需用的= ;母株瓶数较少，产苗&#= 25968;（即生根的瓶数×ે= 9;瓶植株数）较多；反&= #20043;，增殖倍率低，因&= 656;要维持原增殖瓶数，= ;就占用了不少材料，&#= 20197;致不可能有较多的Ĉ= 48;料用于生根，出苗数= 就少。可见调整最佳= 2521;养基，提高增殖倍= 5;是很重要的研究项目&= #12290;
每天接种生根的株ă= 68;便是今后每天出瓶苗= 数。
全年出瓶苗数（P）= =3D 全年总工作日×&= #24179;均每工作日出瓶小= 893;株数×（1一损耗率10％）
全年产苗数×移栽ৎ= 4;活率－实际年产苗数<= /span>
按公式计算的数字ÿ= 11;制增殖总瓶数，可以= 使处于增殖阶段的苗= 3376;在二个周期内全部ੋ= 6;新一次培养基，使苗&= #23376;全部都处于不同生&= 271;阶段的最佳状态。下= ;面一个实际例子计算&#= 19968;下就会更清楚了。
某实验室培养多种Č= 93;物，它们平均35天为一个&#= 22686;殖周期，按要求必Ɔ= 35;在42天全部更&#= 26032;一次培养基。那么Ë= 20;掌握的处理继代操作= 的能力，在35～= 42天内能处理多少= 瓶，架子上增殖的瓶= 5968;就不应超过这一数ढ= 3;。假定你自己整天可&= #20570;接种工作。平均每= 825;取用30瓶母种；&#= 36716;接成100瓶，= 其中30瓶为增殖&#= 29992;，以维持母株的瓶ă= 68;，另70瓶用于生&#= 26681;。在35～= 42天内有30～36个工作日，那么= 几项数字计算如下：
存架增殖总瓶数= T＝= 30 × 30或30× 36 即：T＝900或1080（瓶）
&n= bsp; 增殖与生根比例= 为3：= 7，每天出瓶700苗（= 70瓶），全&#= 24180;出瓶苗数(P)＝<= span lang=3DEN-US>300（工= 作日）× 700×（<= /span>1一损耗率10％）=3D210，<= span lang=3DEN-US>000(株<= span lang=3DEN-US> )×9= 0%＝189，000（株）
全年实产成活幼=
苗数：189000×
如果生根需2～=
3周，那么生根阶=
段的瓶子存架数也可=
1639;出（2～=
3周内有12～19个工作日）：<=
span
lang=3DEN-US>12 × 在1个人全力接种的=
条件下，需培养架4个左右。&#=
25552;高利用率的最好办Ė=
61;是加强周转。 &n=
bsp;
再如你的&#=
26102;间和条件都有限，Ë=
20;要抓紧制做培养基和=
高压灭菌，然后利用=
7604;较集中完整的一段ਲ=
2;间，摆上自制的无菌&=
#25509;种箱做接种操作。=
914;在40天的周期&#=
20869;总共可做6次接种，&#=
27599;次处理增殖好的材Ą=
09;10瓶，接种&#=
21040;35瓶，其中10瓶仍维持&#=
22686;殖，余下的25瓶使幼苗&#=
29983;根，那么上述几项ă=
68;字计算如下： 存架增殖总瓶数=
T＝=
10×6＝60（瓶） 增殖与生根的比=
例为：10:25 即<=
span
lang=3DEN-US>1：=
2．5 每次25瓶，40天内接种6次，6×25=3D150（瓶） 全年出瓶苗数：=
40天一个周&#=
26399;，
全年做 全年实产成活苗=
数：12150× &n=
bsp;
存架生根&#=
33495;总瓶数：如苗子能ß=
12;3周内生根&#=
65292;需占用75瓶，在 从上面的例子也说ą=
26;，快速繁殖的速度的=
确很可观的，快速繁=
7542;是由较高的增殖倍ਤ=
8;，较短的增殖周期和&=
#21608;年生产这三个因素 =
452;成的，凡是应用于生=
;产的种类都必需满足&#=
36825;三个因素，尤其是Ļ=
32;一、二个因素，如果=
达不到要求，那还是=
2788;于研究、开发阶段=
0;种类。还要考虑整套&=
#25216;术，比如无菌操作=
981;熟练，污染比例太高=
;，出了苗栽不活等等&#=
12290;
在总体设计上当=
然要计划安排出幼苗=
0986;瓶种植的工作量。߭=
4;是一个生产体系效率&=
#39640;不高，接种工序影=
709;最大，是试管繁殖中=
;最核心的技术，目前&#=
19990;界各地都还处于手ð=
37;操作阶段，短期内不=
太容易实现自动化。=
7599;个操作工1天最大工&#=
20316;量为200个培=
养容器，每容器接种
植物的快速繁殖= 也应推行有效的管理= 1150;法，以迅速提高生ߝ= 5;效率。比如，按植物&= #31867;型不同，无菌操作= 797;杂程度不同，分别制= ;定出工作的质量与数&#= 37327;标准，对从事操作į= 40;人员给予短期严格训= 练，挑选优秀的人员= 2266;定在岗位上，同时ಯ= 3;予有吸引力的报酬。&= #25509;种环节加速了，其= 427;环节的运转也自然被= ;带动起来。
本章小结
1．<= /b>植物组织培养技= 术包括灭菌、接种、= 2521;养和驯化四个环节Ӎ= 0;
2．<= /b>灭菌是指用物理= 或化学的方法杀死物= 0307;表面和孔隙内的微ஶ= 3;物及其孢子。消毒是&= #25351;杀死、消除或抑制%= 096;分微生物的活动，使= ;之不能再发生危害作&#= 29992;，不如灭菌彻底。
3ᦁ=
4;६=
0;用的灭菌方法有两种&=
#65306;物理方法和化学方=
861;。干热、湿热、射线=
;处理、过滤等属于前&#=
32773;；升汞、来苏水、ƌ=
40;锰酸钾、酒精等化学=
药剂处理则属于后者=
2290;
4ᦁ=
4;࣌=
1;养基一般采用湿热灭&=
#33740;法；耐热的玻璃器 =
399;和器械一般采用干热=
;灭菌法；镊子等接种&#=
29992;工具则采用灼烧灭ő=
40;法；不耐热的物质如=
生长调节剂等一般采=
9992;过滤除菌法。
5ᦁ=
4;ོ=
0;压蒸汽灭菌前，要注&=
#24847;排净里面的冷空气A=
307;保压时间到达后，要=
;使指针回零才能开盖&#=
21462;物。
6ᦁ=
4;৶=
9;种程序包括（1）植物材料表༣=
4;的消毒，（2）切割外植体ᦁ=
2;（3）将外植体移ࠣ=
7;培养基。
7ᦁ=
4;࣌=
1;养方法主要有固体培&=
#20859;法和液体培养法。=
069;者是比较常用的方法=
;，简便易行。
8ᦁ=
4;৶=
9;种后材料的培养步骤&=
#21487;分为：（1）初代培养，ᦀ=
8;2）继代培养，ᦀ=
8;3）生根培养。
9ᦁ=
4;ཱ=
5;化时要注意培养基质&=
#30340;选择和温、光、水=
289;肥、气的综合管理。=
;
10ᦁ=
4;ࢷ=
2;快速繁殖计划安排上&=
#65292;要注意增殖倍数与 =
616;有的人力、物力相协=
;调，以提高生产效率&#=
12290;
复习思考&#=
39064;
1．灭菌和消&#=
27602;有何差别？为什么ʍ=
11;
2．常用的灭&#=
33740;方法各有哪些优缺Ġ=
57;？
3．采用高压&#=
33976;汽锅高压灭菌时，ò=
12;注意哪些事项？
4．实验人员进入=
接种室接种之前，应=
0570;哪些准备工作？
5．接种的植&#=
29289;材料如何进行预处ĩ=
02;？如何接种？
6．根据发育&#=
26041;向，初代培养可分È=
26;几种类型？
7．组织培养&#=
20013;，怎样尽量避免出Ĩ=
16;褐变和玻璃化苗？
8．试管苗驯&#=
21270;中应注意调节什么Þ=
40;素？
9．如何估测&#=
22686;殖率？如何安排快Ű=
95;繁殖计划？